分类目录归档：设计控制

International Medical Device Regulators Forum

The International Medical Device Regulators Forum (IMDRF) was conceived in February 2011 as a forum to discuss future directions in medical device regulatory harmonization.

It is a voluntary group of medical device regulators from around the world who have come together to build on the strong foundational work of the Global Harmonization Task Force on Medical Devices (GHTF), and to accelerate international medical device regulatory harmonization and convergence.

http://www.imdrf.org/index.asp

注册检验相关资料清单

1.申请单位出具的检验申请函，加盖申请单位公章；检验申请表(请登记联系人电话和E-mail信息)；

2.证明文件：申请人企业许可证（复印件）, 提交资料真实性的声明。

3.抽样单（抽样凭证及记录），加盖抽样单位公章；

4.综述资料；

5.产品说明书；

6.拟定申报产品技术要求；

7.主要原材料研究资料；

8.分析性能评估资料；

9.参考值（范围）确定资料；

10.稳定性研究资料；

11.标准品（参照品）及资料（包括企业提供的标准品的溯源性、制备过程、浓度及测定方法、批次、效期、使用说明、储存条件信息；另外，检验中如有需要，申报单位应在接到通知后10个工作日内提供均匀性和不确定度的相关数据资料）；

12.自检报告；

13.工艺及反应体系研究资料（送检时可暂不提供，检验中如有需要，应在接到通知后10个工作日内提供）；

14.生产记录（送检时可暂不提供，检验中如有需要，应在接到通知后10个工作日内提供）。

以上资料均需加盖申请单位公章。

核酸扩增法检测试剂主要原材料选择

核酸扩增法检测试剂的主要原材料包括：dNTP、引物、探针、酶、参考品或标准品等。

核酸扩增技术泛指以扩增脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）为手段，检测特定核酸序列或筛查特定基因的检测技术，如聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、转录依赖的扩增反应（TMA）等。核酸扩增法检测试剂是基于核酸扩增检测技术的体外诊断试剂，目前已经用于病原体检测、特定疾病的早期诊断和体内物质的型别鉴定等不同领域。

基本原则：

1. 应提供主要原材料如引物、探针、企业参考品或标准品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质量标准等的相关研究资料。

2. 若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定；

3. 如主要原材料来自市场（从其他单位购买），应提供的资料包括：对物料供应商审核的相关资料、购买合同、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。

4. 主要原材料（包括生产工艺）或其供应商发生变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。

5. 核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

1.脱氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的组成成分，包括：dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP。

dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP适用于 PCR扩增、DNA测序、合成、标记和其它基于DNA聚合酶的DNA合成技术。

应为高效液相色谱（HPLC）纯、PCR级，无DNase和RNase污染。-20℃保存。

供应商：Sigma-Aldrich（is now Merck）、Aladdin

制造商：Roche、Invitrogen、ThermoFisher、Promega、NEB

2′-脱氧腺苷-5′-三磷酸 钠盐 溶液，dATP

2′-脱氧胞苷 5′-三磷酸 钠盐，dCTP

2′-脱氧鸟苷 5′-三磷酸 钠盐 溶液，dGTP

2′-脱氧胸苷-5′-三磷酸 钠盐 溶液，dTTP

2′-脱氧尿苷 5′-三磷酸 钠盐 溶液, dUTP

2.引物

由一定数量的dNTP构成的特定序列，通常采用脱氧核糖核酸（DNA）合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。

冻干粉，序列正确，合成量应达到试剂生产要求。

纯度应达到电泳级（PAGE）或HPLC级，不含杂带。

应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱。

应作HPLC分析和紫外光吸收分析。

以紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间，可视为合格引物。-20℃保存。

干粉DNA从有机溶剂中干燥出来，无菌，无核酸酶。可以室温或-20℃密闭长期保存。溶解以后的DNA最好保存在-20℃，溶解引物的水的PH要求大于7.0，并且无菌。带有荧光标记的引物请注意避光保存。

制造商：ThermoFisher 、Sigma-Aldrich（is now Merck）、IDT

Primer设计的基本原则是什么？

引物长度一般在18-35mer。

G-C含量控制在40-60%左右。

避免近3’端有酶切位点或发夹结构。

如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。

如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。

避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。

退火温度Tm控制在 58-60C左右。

如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。

如何计算引物的Tm值？

引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)

对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size

公式中，Size = 引物长度。上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。

合成原理

Oligo DNA的人工化学合成始于50年代初期，1980年，全自动的固相DNA合成仪面市后，使得快速、高效合成Oligo DNA成为可能，这大大地推动了生物工程技术的蓬勃发展。现在一般都采用β-乙腈亚磷酰胺化学合成Oligo DNA，合成时从3′ →5′ 方向进行，通常3′ 端的第一个碱基结合在Glass担体 (Controlled Pore Glass，CPG)上。合成的详细过程见下图，现简要说明如下：

1. Step1：脱掉附加在CPG担体上的第一个碱基5′ -OH基团上的保护基 (DMTr)，准备附加下一个新的碱基；

2. Step2：活化新的碱基单体 (Phosphoramidite)，准备与第一个碱基进行反应；

3. Step3：第二个碱基与第一个碱基发生偶联反应；

4. Step4：将没有反应的第一个碱基的5′ -OH加帽封死 (Capping)，使其不再进一步参与反应；

5. Step5：将核苷亚磷酸酯氧化成更稳定的核苷磷酸酯 (即将三价磷氧化成五价磷)。

6. 重复进行Step1～Step5的循环，直至合成完所需的Oligo DNA序列。

7. 合成结束后，将Oligo DNA分子从CPG上切下，再进行进一步的纯化。

纯化方法描述优点

脱盐(DSL)

通过在高纯氨气水蒸汽混合物的气相氨解环境下将连接在CPG上的引物切割洗脱下来， 能有效地去除盐分，但不能有效去除比目的片段短的小片段 。毛细管电泳（Capillary Electrophoresis）纯度大于45%。

高亲和纯化/TON纯化

基于特异和反相层析法，从合成好的产物中去除失败序列，提供最终的目标序列。适于35个碱基以下的引物。毛细管电泳（Capillary Electrophoresis）纯度大于75%。

聚丙烯酰胺电泳(PAGE)

利用不同长度序列DNA在凝胶中迁移率不同来分离目标序列和失败序列，从而提供高纯度的目标引物。 对长链Oligo DNA (大于40 mer)的纯化特别有效。 毛细管电泳（Capillary Electrophoresis）纯度大于85%。

高效液相(HPLC)

利用DNA片段大小和带电电荷的不同来分离纯化引物，是一种广泛使用且非常有效的纯化方式，能达到很高的纯度和灵敏度，特别适合40个碱基以下的引物，毛细管电泳（Capillary Electrophoresis）纯度大于85%。

如何测定引物的OD值？

用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的光密度来定量。请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-0.8之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色杯中测定其光密度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。

举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50微升稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的光密度为0.25，说明该50微升中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。

如何检测引物的纯度？

实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。(有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二级结构条带。)

3.探针

是指特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。

通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化，在5′-端(和/或3′-端)进行标记，如荧光素报告基团或其他发光标记物，在3′-端标记荧光素淬灭基团，并经HPLC或其他适宜方法纯化。

冻干粉，纯度应达到HPLC纯。应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如HPLC分析图谱；应对探针的核酸序列及标记的荧光素或化学发光物进行核实，并作HPLC分析。应以可见—紫外分光光度计进行200-800nm扫描，在260nm处应有吸收峰。

另外，根据标记荧光素的不同，还应该在荧光素的激发波长处有吸收峰，如FAM荧光素在494nm、TET荧光素在521nm、TAMRA荧光素在560nm处有特异的吸收峰，杂交探针在493nm、625nm、685nm处有特异的吸收峰，检定合格后入库。避光、-20℃保存。

TaqMan 探针设计的基本原则是什么？

TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。

长度一般为18-40mer 。

G-C含量控制在40-80%左右。

避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。

在引物的5’端避免使用G。

选用比较多的碱基C。

退火温度Tm控制在 68-70℃左右。

4.DNA聚合酶

如Taq DNA聚合酶。应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃保温1小时后仍保持50%活性。-20℃保存。

制造商：Roche、ThermoFisher、Promega、NEB、TOYOBO

5.尿嘧啶糖基化酶（UNG）

具有尿嘧啶糖基化酶活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性，1U UNG在 37℃处理3分钟后，10*3拷贝以下含U模板应完全降解，不能产生扩增产物。-20℃保存。

制造商：Roche、ThermoFisher、Promega、NEB、TOYOBO

UNG和UDG有什么区别？

肯定的说，对于qPCR的使用目的，UNG和UDG是没有区别。UNG和UDG通常可互换使用，因为它们在qPCR中执行相同的功能——即防止携带污染。UNG/UDG的生物学功能是从DNA中去除尿嘧啶，在DNA中产生游离的尿嘧啶和碱敏感的嘧啶位点。 UNG/UDG通过催化水解尿嘧啶和糖之间的N-糖基键从而去除掺入单链和双链DNA中的尿嘧啶。最值得注意的是，UNG/UDG更喜欢作用于单链尿嘧啶模板。

由于PCR可以扩增微量DNA，因此防止污染至关重要，即使少量污染也会在实验中产生假阳性。污染的来源可能包括：来自其他样品的交叉污染，或来自实验室其他地方的DNA污染，或以前实验中使用的扩增产物和引物的携带污染。扩增产物的污染导致PCR实验中出现许多假阳性结果。然而，防止污染很困难，必须采用特殊的实验室程序，以确保在后续实验中不会重新扩增剩余的DNA残留物。

UNG/UDG可以专门降解PCR扩增产物。 UNG/UDG可以降解之前的PCR扩增或错误引发的非特异性扩增产物，保留天然核酸模板的完整。 UNG/UDG活化作为PCR的第一步，反应条件为37~50℃温育2分钟。UNG/UDG对单链和双链含dU的DNA有活性，但dUTP不是UNG的底物。 Taq聚合酶和PCR混合物的其他组分不受UNG处理的影响。只有UNG处理才能去除残留产物。含有dU的PCR产物在印迹，克隆和测序中表现得像天然含dT的DNA，并且UNG的存在不会影响大多数PCR后分析。此外，UNG不会影响DNA的电泳迁移率或溴化乙锭染色效率，也不会影响您的实验结果。为防止qPCR中的遗留污染，请使用包含UNG/UDG的主混合液。

尽管UNG/UDG提供了优势，但UNG/UDG未完全热灭活，并且随着时间的推移会降解PCR产物，这将影响PCR实验的结果。如果您正在运行基因分型实验并计划在以后执行终点读取，建议不要使用UNG。

UNG/UDG（从大肠杆菌克隆）也不推荐用于一步法RT-PCR应用，因为产生cDNA的逆转录步骤将掺入dU-核苷酸，因此UNG在反应中降解。解决方法是在单独的反应中将RNA转化为cDNA。或者使用热不稳定UNG（从大西洋鳕鱼种克隆）的一步法RT-PCR主混合液。热不稳定UNG可以在50-55℃逆转录步骤中被激活，因此含有dU碱基的第一链cDNA不会被降解。

尽管UNG/UDG积极防止未来样品污染，但它无法从仅含dT的PCR产物中去除先前存在的污染物。扩增的序列应含有dA和dT核苷酸，只有具有这些核苷酸的DNA序列才会产生可被UNG/UDG降解的含dU的PCR产物。引物应在其3’末端附近含有dA，因此产生的引物二聚体至少与含有dU的PCR产物一样有效地被UNG/UDG降解。 dA离3’末端越远，部分降解的引物二聚体越可能作为后续PCR扩增的模板。产生这样的引物二聚体可能损害所需靶区域的扩增。如果不能使用末端附近具有dA的引物，则考虑具有3’末端dU的引物。末端dU不是UNG/UDG的底物，这些引物不会降解。UNG/UDG也不适合用于扩增含dU的PCR产物，如巢式PCR方案，因为酶会降解含dU的PCR产物，阻止进一步扩增。 此外，UNG/UDG不适合扩增亚硫酸氢盐转化的DNA模板。 这是因为亚硫酸氢盐将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶残基。一般情况下，任何时候你想在运行结束后使用扩增子，但也许不是立即使用，最好使用没有UNG的主混合液。由于UNG/UDG的活性低于55°C，这应该是PCR扩增的最低退火温度，以避免新合成的含dU的PCR产物因残留的UNG活性而降解，即使经过长时间的变性步骤。

6.逆转录酶

具逆转录酶活性，无核酸内切酶活性。-20℃保存。

制造商：Roche、ThermoFisher、Promega、NEB、TOYOBO

7.参考品

注册检验用体外诊断试剂国家标准品和参考品目录的通知

8.标准品

国家微生物资源平台

http://www.nimr.org.cn

美国菌种保藏中心

https://www.atcc.org

中国工业微生物菌种保藏管理中心

http://www.china-cicc.org/

标准物质查询与订购平台

http://www.nifdc.org.cn/bzwz/CL0481/

注册检验用体外诊断试剂国家标准品和参考品目录的通知

http://www.nifdc.org.cn/bzwz/CL0276/

生产工艺

核酸扩增类检测试剂的基本生产工艺通常包括：配制工作液、半成品检定、分装和包装。配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对pH、电导率等关键参数进行有效控制。

工艺研究的资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如样本类型、样本用量、试剂用量、反应条件、校准方法、质控方法、临界值的确定、稳定性和有效期，提供确切的依据。

质量控制

1.半成品质量控制

（1）按批号抽取规定数量的半成品。

（2）以参考品/对照品进行半成品质量控制。如果产品具有国家标准品或参考品，应以其进行检定。如果产品不具有国家标准品或参考品，应根据规定制备相应的企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

（3）半成品检定内容包括：阴/阳性参考品符合率、灵敏度、特异性、精密度。检测结果应符合质量标准的要求。

（4）半成品检定合格后，按试剂盒组成及时进行分装和包装。

2.成品质量控制

（1）每一批核酸扩增法检测试剂的试生产量应满足工艺研究、分析性能验证、稳定性研究、临床试验、自测及注册检验等各阶段所需样品量的要求。

（2）产品完成包装后，应根据生产量进行抽样和生产记录审核。

（3）以参考品/对照品进行成品质量检验。结果应符合要求。

（4）成品检验的内容应包括：阴/阳性参考品符合率、灵敏度、特异性、精密度、线性范围（定量产品）和稳定性。

5．试剂批放行前，应对需要进行稳定性考核的试剂成分，在特定温度或条件下进行稳定性试验。稳定性试验可采用加速破坏试验。